FISH

一、FISH探針是個啥？

熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization），簡稱FISH。 是采用熒光標(biāo)記的DNA探針，利用探針與被檢測樣本DNA堿基對的互補性，在探針與樣本的DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號而得出結(jié)果，從而檢測細(xì)胞，組織樣本中的染色體或基因異常。

首先，我們知道需要檢測的對象是DNA，而檢測目標(biāo)DNA所用的工具是用熒光染料做了標(biāo)記的DNA，能夠被觀察到，這個就是FISH探針了。

熒光信號最終需要被肉眼觀察到，而肉眼的分辨率是有限的，所以FISH探針的大小一般都比較長一點，多數(shù)有幾百個kb。由于本身這個特點，F(xiàn)ISH探針適用于檢測染色體的斷裂融合或者大片段的擴(kuò)增、缺失或者染色體數(shù)目的變化，而不適用于突變檢測。

以最常見的HER2產(chǎn)品為例，設(shè)計原理如下：

HER2基因位于17q11.2-q12，設(shè)計者把HER2探針標(biāo)記為紅色，使其能夠覆蓋HER2基因，同時，由于著絲粒相對保守，把相應(yīng)位點標(biāo)記為綠色作為對照。

設(shè)計者選擇位點的差異以及工藝技術(shù)的差異則造成了不同探針敏感性和特異性的差異。

二、工欲善其事，必先利其器

目前市場上在售的FISH探針，顏色各不相同，那是因為標(biāo)記的熒光素各不相同，主要的有以下幾種：

熒光素	顏色	激發(fā)波長	發(fā)射波長
FITC	綠色	492	520
Cy3	橙色	550	570
TRITC	橙紅色	550	620
Texas Red	紅色	596	620
SpectrumOrange	橙色	559	588
SpectrumGreen	綠色	497	524
SpectrumAqua	青藍(lán)色	433	480
DAPI	藍(lán)色	367	452

熒光想被看到，需要被特殊光源激發(fā)后通過合適的濾光片才行，所以，探針生產(chǎn)商會在說明書上標(biāo)明自己生產(chǎn)探針?biāo)褂玫臒晒馑胤N類，然后建議“顧客使用探針前向濾片組供應(yīng)商了解所使用的濾片組的詳細(xì)情況，以便選擇與標(biāo)記熒光染料相適應(yīng)的濾片組”。選擇合適的濾光片是非常重要的，畢竟我們通過觀察FITC的濾光片怎么也看不見Cy3不是？

以常見的奧林巴斯BX53顯微鏡為例（其他品牌也差不多），它的濾光單元長這樣：

上圖中手里拿著的小結(jié)構(gòu)就是已經(jīng)裝了盒的濾光片。用來觀察FISH實驗結(jié)果的熒光顯微鏡，通常至少安裝有3組濾光片，分別用來觀察橙色、綠色以及藍(lán)色的熒光。濾光片可以單獨安裝，所以，實驗室如果已安裝了熒光顯微鏡，那么在開展了新項目包含了新的熒光素種類時，拓展一個相應(yīng)的濾色片就可以。

熒光顯微鏡中，除了濾色片，激發(fā)光源也需要注意，目前大多數(shù)熒光顯微鏡使用的是汞燈作為光源，而汞燈是有使用壽命的。所以，用了一段時間后，激發(fā)出的光變的弱了，老師，您的顯微鏡不是壞了，只是汞燈老了，換個嫩的就行。

FISH實驗中，主要的儀器除了熒光顯微鏡，還有原位雜交儀：

原位雜交儀承擔(dān)了探針和樣本變性以及雜交的重任，可以提供精確且均一的溫度。

原位雜交儀不僅可以用來進(jìn)行熒光原位雜交的實驗，也可以做原理類似的其他標(biāo)記物（例如地高辛）標(biāo)記的原位雜交實驗。

三、標(biāo)準(zhǔn)化是有必要的

FISH操作的步驟好像每一家都不是很一樣，它們之間的差異體現(xiàn)在哪兒？

其實，不論具體的步驟，F(xiàn)ISH實驗過程都可以被分成幾個大的部分：

根據(jù)樣本類型的不同，前期處理的方法也不同。目的在于保持組織細(xì)胞形態(tài)的完整，讓細(xì)胞或者組織以最好的狀態(tài)呈現(xiàn)在載玻片上。以最常見的石蠟樣本為例，推薦的處理方法如下（這個大家區(qū)別不大）：

常溫下在10%中性福爾馬林緩沖液中固定24小時，為了達(dá)到最佳和均勻的固定和石蠟包埋，樣本大小不宜超過0.5cm3。標(biāo)準(zhǔn)操作和石蠟包埋，使用高質(zhì)量的石蠟。滲透和包埋應(yīng)在低于65℃下進(jìn)行。切成4μm厚度的切片。切片撈于防脫玻片并在50~60℃環(huán)境中固定2~16小時。

預(yù)處理包括脫蠟、預(yù)處理、酶消化，目的在于把細(xì)胞核裸露出來、增加膜的通透性，讓探針可以更好的進(jìn)入細(xì)胞核與染色體DNA結(jié)合。由于各家探針生產(chǎn)商生產(chǎn)的探針敏感性和特異性有差異，對樣本處理完的狀態(tài)要求也不盡相同（比如：探針敏感性足夠好，預(yù)處理的不是很好，探針也可以穿過核膜與染色體結(jié)合），所以預(yù)處理的條件會有一定的差異，各生產(chǎn)商所建議的預(yù)處理條件都是經(jīng)過多次試驗證明與其探針相適應(yīng)的，因此建議實驗過程中按照生產(chǎn)商提供的說明書進(jìn)行操作。

同理，探針的變性和雜交的過程就是探針與目標(biāo)DNA的結(jié)合過程，想要結(jié)合的好，就需要理想的化學(xué)和溫度條件，而這個條件也是經(jīng)過梯度實驗最終確定的。

而雜交后洗脫的條件與變性雜交的條件有一定的關(guān)系，洗脫的溫度與時間都與探針最終的結(jié)合情況相關(guān)，通俗來講，如果結(jié)合的好，那么洗的厲害點也沒關(guān)系，如果結(jié)合的不好，就得悠著點洗了。DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，因為DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜，所以在FISH實驗中用于細(xì)胞核的復(fù)染。

綜上，由于各家探針敏感性和特異性的不同導(dǎo)致的所有操作條件上的差異，都是系統(tǒng)性的，因此在實驗過程中，并不建議不同生產(chǎn)商的探針和輔助試劑混用，按照說明書上的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行，有助于得到理想的實驗結(jié)果。當(dāng)然，如果您的實驗室已經(jīng)通過實驗確定了自己的標(biāo)準(zhǔn)操作條件，就大膽的上吧。